Analysis of an approach to oviduct-specific expression of modified chicken lysozyme genes.

The –2.7 kb enhancer (E) element of the chicken lysozyme gene domain appears to govern expression of the gene in macrophages but not in oviduct tubular gland cells, the only other site of lysozyme expression. The ultimate goal of our research was to determine whether lysozyme domain variants could be developed that would mainly be expressed in the oviduct so that transgenic birds could be produced that would deposit exogenous protein in the egg white. Accordingly, precise mutations were made by poxvirus-mediated gene targeting in FEF/PU.1 and CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) transcription factor binding sites in the –2.7 kb E of cloned copies of a specific lysozyme gene variant that includes a hydrophobic pentapeptide tail encoding sequence inserted immediately prior to the stop codon. This variant contains the entire lysozyme domain and is cloned in a λ bacteriophage vector (λDIILys-HT); the novel tail sequence enables distinction in cell-based expression systems between transcripts of the variant and those of the endogenous gene. These various lysozyme domain mutants, in bacteriophage vector form, were tested for expression in cultured chicken blastodermal cells cotransfected with plasmids encoding the transcription factors C/EBP and v-Myb. In the absence of these plasmids, barely detectable levels of endogenous lysozyme gene transcription resulted in the blasto dermal cells. In the presence of the plasmids, however, transcripts of the endogenous gene could be detected as well as varying levels (as evaluated by quantitative real-time PCR) of transcripts of all of the lysozyme domain mutants. These results are discussed in the context of the known role and occurrence of various transcription factors involved in gene expression in differentiating macrophage cells. The ultimate test of expression of the variants in macrophages vs. oviduct cells will be to use them to produce transgenic birds. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

L'élément amplificateur –2.7 kb du gène du lysozyme semble régir l'expression du gène dans les macrophages contrairement aux cellules tubulaires de l'oviducte, le seul autre site où le lysozyme est exprimé. Le but de notre recherche est de déterminer si des variants du lysozyme qui sont principalement exprimés dans l'oviducte peuvent être développés, permettant de générer des oiseaux transgéniques qui auraient la propriété de déposer une protéine exogène dans le blanc d'œuf. Ainsi, des mutations précises ont été introduites par ciblage génique par l'intermédiaire du poxvirus dans les sites de liaisons des facteurs de transcription FEF/PU.1 et C/EBP de l'élément amplificateur –2.7 kb d'un variant spécifique du gène du lysozyme qui possède une séquence codant un pentapeptide inséré immédiatement en amont le codon de terminaison. Ce variant contient le domaine complet du lysozyme et est cloné dans un vecteur bactériophage lambda (λDIILys-HT); la nouvelle queue pentapeptidique permet de distinguer les transcrits du variant de ceux du gène endogène, dans notre système d'expression cellulaire. L'expression de ces différents mutants du lysozyme sous forme de vecteur bactériophage, a été testée dans des cellules de blastoderme du poulet en culture, co-transfectées avec des plasmides codant les facteurs de transcription C/EBP et v-Myb. En absence de ces plasmides, des niveaux quasi-indétectables de lysozyme endogène ont été mesurés dans les cellules de blastoderme tandis qu'en leur présence, les transcrits du gène endogène pouvaient être détectés, ainsi que des niveaux variables (tels qu'évalués par PCR quantitatif en temps réel) de transcrits des mutants du lysozyme. Ces résultats sont discutés dans le contexte du rôle connu et de l'occurrence de plusieurs facteurs de transcription impliqués dans l'expression génique des macrophages en différenciation. Le test ultime de l'expression des variants dans les macrophages vs les cellules de l'oviducte sera de les utiliser pour produire des oiseaux transgéniques. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

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